Экспериментальное заражение для изучения вирусов

Нельзя изучать вирусы, не имея в своем распоряжении методов, позволяющих выявить присутствие этих патогенных агентов и осущест­вить их идентификацию. Это условие в равной степени обязательно вне зависимости от того, хотим ли мы изучать вирусы, имея в виду опреде­ление их свойств, или нашей целью является выделение вируса из боль­ного организма-хозяина. О присутствии вируса в организме как при спонтанном заболевании, так и при экспериментальном заражении хо­зяина судят по появлению каких-либо аномальных реакций. Лишь в крайне редких случаях вирус удается выявить непосредственно путем визуального наблюдения вирусных частиц. Поскольку, находясь вне клетки, вирусы метаболически инертны, т. е. не размножаются и не вызывают активных изменений окружающей среды, все наиболее важные формы их активности реализуются внутри клеток организма-хозяина и проявляются в виде симптомов соответствующего заболевания.

Всякий раз, когда возникает подозрение о присутствии вируса в изу­чаемом объекте, приходится подбирать соответствующий комплекс усло­вий— подходящий организм и адекватный способ заражения, ведущий к появлению у зараженного организма распознаваемых изменений. По­этому, подобно тому как в практике бактериологических исследований большую часть времени занимает культивирование бактерий, при виру­сологических исследованиях значительное количество усилий преходится тратить на разработку методов экспериментальных инфекций и их про­ведение. Экспериментальная вирусная инфекция аналогична опыту, целью которого является выращивание бактерий. Применяемые в бак­териологии метод культивирования на селективных средах и метод обо­гащения имеют соответствующие аналоги в вирусологии.

Рассмотрим теперь проблему диагностики вирусных инфекций. Изве­стно, что для доказательства того, что данное заболевание действительно вызывается каким-то определенным микроорганизмом, необходимо вы­полнить так называемые постулаты Коха:

• 1) показать, что данный мик­роорганизм регулярно обнаруживается в больном организме,
• 2) полу­чить культуру этого микроорганизма на искусственной питательной сре­де,
• 3) пользуясь выделенной культурой микроорганизма, воспроизвести данное заболевание на экспериментальном животном и, наконец,
• 4) пов­торно выделить данный микроорганизм, но теперь уже из организма искусственно инфицированного хозяина.

Те же постулаты mutatis mutan­dis справедливы и для диагностики вирусных заболеваний. В этом слу­чае, согласно Риверсу, предъявляемые требования формулируются сле­дующим образом:

• 1) необходимо выделить вирус из организма больного хозяина,
• 2) культивировать вирус в организме или в клетках экспери­ментального хозяина,
• 3) доказать фильтруемость инфекционного агента (чтобы исключить патогенные агенты большего размера, например бак­терии),
• 4) воспроизвести подобное же заболевание у иной особи данного или родственного вида,
• 5) повторно выделить данный вирус.

Культивирование и идентификация вирусов — основные вирусоло­гические методы, используемые в практической вирусологии при диагно­стике вирусных заболеваний. Эти методы являются также основным инструментом любого вирусолога вне зависимости от того, исследует ли он теоретические проблемы репродукции вирусов, изучает ли патологию клеток при вирусных инфекциях или эпидемиологию вирусных заболева­ний или занимается вопросами профилактики, вакцинации или химио­терапии. Несмотря на то, что общих правил культивирования и иденти­фикации вирусов пока не существует, имеет смысл более подробно обсу­дить некоторые аспекты культивирования вирусов, целью которых является их концентрирование и идентификация.

Во-первых, обсудим вопрос об источниках получения материала, со­держащего вирусы, и условиях его сохранения. Материал, в котором по­дозревается наличие вируса, например лизат бактерий, кусочек ткани или биологическая жидкость, следует оберегать от нагревания и других резких воздействий. Часто бывает желательно хранить материал, содер­жащий вирус, при очень низких температурах (—70°). При необходимо­сти из ткани следует приготовить суспензию, измельчая ее путем расти­рания в смеси со стерильным песком или порошкообразным стеклом, как правило на холоду, и добавляя к смеси буферный раствор. Для того чтобы удалить из суспензии большие фрагменты клеток и загрязняющие ее микроорганизмы, можно применить центрифугирование и фильтрова­ние. Получив такую суспензию, следует заразить ею подходящего экспе­риментального .хозяина. Выбор хозяина и способа введения материала определяется природой предполагаемого вируса и часто является прин­ципиально важным. Цель данной работы — вызвать у подопытного хо­зяина четко выявляемые симптомы заболевания.

Различают два типа экспериментальных инфекций:

1. инфекции, на которые организм реагирует общей реакцией,
2. инфекции, на которые организм реагирует местной реакцией.

Для того чтобы вызвать местную реакцию, содержащую вирус жид­кость следует нанести на слой чувствительных, клеток таким образом, чтобы вирус смог инфицировать одну или большее число клеток, размно­житься в них, проникнуть затем в соседние клетки и в результате вы­звать изменения, видимые простым глазом. Местные (локальные) изме­нения могут быть вызваны полной или частичной деструкцией или ано­мальной пролиферацией клеток. Появление повреждений, как правило, является достаточно характерным признаком, свидетельствующим о на­личии вируса. Соответствующие примеры будут приведены ниже. Число локальных поражений говорит о числе успешно осуществленных инфи­цирований.

Для того чтобы изучить общую реакцию организма-хозяина на вве­дение вируса, исследуемый материал вводят в подходящий организм, а затем наблюдают, не появятся ли соответствующие признаки успеш­ного заражения: смерть, заболевание, аномальное развитие организма или какие-либо иные специфические реакции, например образование антител.

При необходимости вызвать локальное поражение главной пробле­мой является выбор тест-системы. Важными параметрами являются при­рода клеточного слоя и условия заражения. При заражении, целью кото­рого является индукция общей реакции у достаточно сложного орга­низма, существенное значение могут иметь оба фактора: выбор хозяина и способ заражения. Экспериментатор должен попытаться либо приве-

сти исследуемый материал в непосредственный контакт с чувствитель­ными клетками, вводя некоторое его количество в соответствующую полость организма, выстланную такими клетками, либо, если это невоз­можно, обеспечить косвенное воздействие путем введения испытуемого материала животному подкожно, внутримышечно, внутривенно или в мозг.

Всегда необходимо поставить соответствующие контроли. В качестве контролей можно использовать растворитель или, что еще лучше, препа­рат нормального незараженного материала, подвергшегося той же обра­ботке, что и испытуемый опытный материал. Последнее особенно важно в связи с тем, что в организмах растений и животных, так же как и в бактериях, могут содержаться латентные вирусы. Поэтому отсутствие адекватного контроля может привести к ошибочному суждению об этио­логической роли обнаруженного вируса при изучаемом явлении. Следует* однако, подчеркнуть, что на латентные вирусы не следует смотреть только как на потенциальный источник ошибок. Обнаружение латентного вируса может явиться для вирусолога важным сигналом, указывающим на его возможную патогенность, а также послужить источником инфор­мации, проливающей свет на природу взаимоотношений между вирусами и организмом-хозяином и проблему происхождения вирусов.

Наконец, возможны случаи, при которых даже успешное заражение может не привести к появлению каких-либо симптомов заболевания. Эта может случиться либо вследствие отсутствия достаточно активного раз­множения вируса, либо из-за неспособности данного вируса вызвать у избранного хозяина какие-либо патологические симптомы. В подобных случаях вирусолог может провести так называемые «слепые пассажи» в надежде, что в результате такого рода пассажей количество вируса настолько увеличится, что путем заражения материалом последнего пас­сажа иных организмов того же или другого биологического вида вирус в конечном счете все же удастся обнаружить.