Как выявляют вирусы у животных?

Комплекс методов, которые следует использовать при изучении экс­периментальных инфекций, определяется видом используемого живот­ного и сложностью его организма. Кожа животных непроницаема для вирусов. Поэтому для того, чтобы вирусы смогли достичь чувствитель­ных клеток, следует либо прибегнуть к инъекции, либо к капельному заражению, например нанося содержащий вирус материал на конъюнк­тиву глаза или слизистую носа. Симптомы вирусной инфекции могут наблюдаться на уровне клетки, ткани и всего организма в целом. Повы­шение температуры, параличи и смерть; воспалительные и дегенератив­ные изменения в тканях легких, печени и других органов; появление геморрагических пятен на коже и слизистых; образование внутриклеточ­ных включений, таких, например, как тельца Негри при бешенстве,— все это симптомы, свидетельствующие о наличии вируса в организме и по­зволяющие его идентифицировать. Однако даже в тех случаях, когда заражение вирусом не приводит к появлению видимых симптомов, нали­чие вируса в организме испытуемого животного может быть выявлено по образованию специфических антител.

Латентный (инкубационный) период

Характерным признаком определенной вирусной инфекции часто яв­ляется латентный (инкубационный) период, т. е. время, прошедшее между заражением вирусом и появлением симптомов соответствующего заболевания. Так, например, у человека при заболевании корью этот период длится 10—12 дней, при заболевании свинкой—18—21 день, а при заболевании оспой — 12 дней. Длительность латентного периода определяется временем, необходимым для достижения вирусом чувстви­тельных клеток и проникновения его в клетку, продолжительностью ре­продукции и выхода вируса из клеток, а также числом повторных циклов репродукции, необходимых для того, чтобы в конечном счете число пора­женных клеток было достаточным для проявления заболевания. Продол­жительность инкубационного периода зависит также от количества вве­денного вируса и пути его введения.

Различия в путях введения вируса могут даже привести к различиям в индуцируемых симптомах. Например, если вирус гриппа ввести мыши в нос, то он вызовет у животного пневмонию, но если тот же вирус ввести в большом количестве в мозг мыши, то он может вызвать токсические симптомы, за которые ответствен абортивный цикл репродукции вируса. Вирус полиомиелита при введении в рот сначала локализуется в клетках эпителия кишечника и лишь изредка проникает в центральную нервную систему. Если же его ввести непосредственно в мозг, то он вы­зовет энцефалит. Для работы с вирусами типа арбовирусов, переносимых в естественных условиях от одного организма к другому членистоногими, было разработано два метода заражения переносчиков:

• 1) непосредст­венная инъекция вируса в организм переносчика
• 2) кормление пере­носчика кровью зараженного организма.

При том и другом способе за­ражения возникают локальные поражения слоев чувствительных клеток. Удобной системой для индукции локальных поражений является хориоаллантоисная мембрана куриного эмбриона. Суспензия вируса, нанесенная на эту мембрану, оказывается локализованной на слое однотипных клеток, фиксированных на своеобразном матриксе, хотя и влажном, но не слишком, так что вирус, выделяющийся из какой-либо клетки мембраны, может распространяться в соседние клетки только контактным способом, а не путем переноса к клеткам, расположенным на отдаленных участках этой мембраны. На хориоаллантоисной мем­бране хорошо растут многие вирусы. При этом образуются характерные очаги поражения, выявление которых часто используется в целях диаг­ностики.

Еще более полезными для выявления вирусов оказались однослой­ные культуры клеток, культивируемых in vitro. В вирусологии исполь­зуют два типа однослойных культур: культуры, образуемые из клеток, получаемых непосредственно из тканей животных (первичные культуры), и культуры, образуемые из установившихся линий культивируемых кле­ток (перевиваемые культуры). Инфицирование таких культур клеток мо­жет привести либо к типичному цитопатическому эффекту, т. е. к дест­рукции клеток, либо к их пролиферации. Если после инокуляции вируса на слой клеток нанести смесь питательной среды с раствором затверде­вающего агара, размножение вируса будет ограничено контактирую­щими друг с другом клетками, в результате чего образуются очаги пора­жений, или бляшки. Вообще говоря, всегда можно подыскать несколько типов клеточных культур, на которых любой дан­ный вирус будет образовывать характерные бляшки. Облегчить выявле­ние бляшек можно путем обработки клеточных культур прижизненными красителями (например, нейтральным красным), позволяющими отли­чить живые клетки от мертвых. Использование однослойных культур клеток и метода бляшек позволило применить для изучения вирусов животных самые разнообразные методы и осуществить большое число весьма тонких экспериментов.

При заражении однослойных культур культивируемых клеток опу­холеродными вирусами могут образоваться центры клеточной пролифе­рации. Образование таких центров является результатом инду­цированной вирусом модификации клеток. Эта вызываемая вирусом мо­дификация приводит к тому, что клетки, которые ранее при размножении могли расти только в виде монослоя (контактное ингибирование клеток), начинают расти, образуя многослойную культуру, т. е. наползая друг на друга.

Может случиться, что вирус, впервые выделенный из инфицирован­ного в естественных условиях материала, на используемой в экспери­менте системе будет размножаться плохо. В этом случае успешное куль­тивирование вируса станет возможным лишь после так называемой адап­тации его к данной системе. Адаптация представляет собой селекцию вариантов, способных размножаться в новом хозяине. Специфичность вируса в отношении хозяина контролируется генетическими свойствами как вируса, так и организма-хозяина и часто бывает весьма узкой. При изучении вирусных инфекций таких видов животных, как, например, мыши, в работе с которыми можно пользоваться чистыми линиями, воз­никает возможность проанализировать ту роль, которую играют генети­ческие свойства хозяина в специфичности эффектов, вызываемых дейст­виями вируса. Например, за полную резистентность мышей линии PRI к вирусу желтой лихорадки штамма 17D ответствен один доминантный ген, подавляющий размножение вирус. Чувствительность клеток кур к определенному штамму вируса РАВ — так называемого Раус-ассоциированного вируса — также детерминируется одним доминантным ге­ном.

Важным фактором, влияющим на результат вирусной инфекции, яв­ляется также возраст животных-хозяев. Ко многим вирусам молодые животные более чувствительны, чем взрослые. Некоторые из таких ви­русов, и в особенности опухолеродные, вызывают типичное заболевание только при заражении ими новорожденных животных. Предполагается, что критическим фактором в этом случае является формирование вскоре после рождения компетентной иммунологической системы. Способность организма-хозяина образовывать противовирусные антитела может при­вести либо к невозможности инфицирования организма вирусом, либо к изменению типа вызываемой вирусом реакции. Например, вирус полиомы вызывает у мышей и крыс опухоли только в том случае, если жи­вотные заражаются вирусом в первые часы или дни после рождения. С другой стороны, вирус лимфоцитарного хориоменингита у новорожден­ных мышей вызывает бессимптомную инфекцию, а у взрослых мышей — аллергическую воспалительную реакцию.

В общем выделение вирусов из природных источников и их иденти­фикация требуют от вирусолога применения всего его мастерства. Для каждого вирусного заболевания приходится разрабатывать свои, спе­циальные методы выделения вируса с тем, чтобы максимально увели­чить шансы на успех. В основе всех этих методов лежат серийные пас­сажи на чувствительных животных одного или нескольких видов и зара­жение тканевых культур в сочетании с различными серологическими тестами.

Освоение методов работы с тканевыми культурами привело к выде­лению многих ранее неизвестных вирусов, причем не только из организ­мов больных, страдавших заболеваниями различной степени тяжести и ранее неизвестной этиологии, но также и из организмов или тканей, не обнаруживавших каких-либо признаков заболевания и не считавшихся вирусоносителями. Эти вирусы были открыты благодаря их способности оказывать на тканевые культуры цитопатогенное или ингибирующее дей­ствие. Иногда затем удавалось получить данные, позволявшие инкрими­нировать некоторым из этих вирусов роль возбудителей уже известных заболеваний. Однако часто создается впечатление, что в организме своего естественного хозяина эти вирусы не вызывают никаких патологических реакций. В подобных случаях возникает вопрос, не относятся ли эти формы к числу вирусов, способных к установлению постоянных проч­ных связей с организмом хозяина, или не образуются ли они вообще из обычных компонентов клетки?